SAMtools flagstat는 BAM, SAM, CRAM 파일의 FLAG 정보를 기반으로 정렬 통계를 계산하고 요약 보고서를 제공하는 품질 관리 도구입니다. 이 도구는 입력 파일을 한 번 완전히 통과하면서 FLAG 필드의 비트 플래그를 기준으로 13개 카테고리의 통계를 산출하여 표준 출력으로 결과를 제공합니다. FLAG 정보는 SAM 형식 사양서에 정의된 비트 플래그로, 각 리드의 정렬 상태와 특성을 나타내는 중요한 메타데이터입니다. flagstat는 전체 서열 수, 매핑된 서열 수, 쌍으로 매핑된(properly paired) 서열 수, 중복(duplicates) 리드 수, 주 정렬(primary), 보조 정렬(secondary), 보완 정렬(supplementary) 등의 세부 통계를 제공합니다. 각 카테고리는 QC 통과(QC-passed)와 QC 실패(QC-failed) 리드로 구분되어 "#PASS + #FAIL" 형태로 출력되며, 매핑 비율, 적절한 페어링 비율 등의 백분율 정보도 함께 제공됩니다. 또한 기본 형식 외에도 TSV(탭으로 구분된 값)와 JSON 형식으로 출력할 수 있어 스프레드시트 소프트웨어나 다른 분석 도구에서 쉽게 활용할 수 있습니다. 이러한 통계 정보는 시퀀싱 실험의 품질을 평가하고, 정렬 과정의 성공률을 확인하며, 데이터의 전반적인 특성을 파악하는 데 필수적인 지표로 활용됩니다. 특히 매핑률이 낮거나 적절하게 페어링되지 않은 리드의 비율이 높은 경우, 실험 조건이나 분석 파라미터를 재검토할 필요가 있음을 시사합니다. Bio-Express의 Whole Genome Sequencing Pipeline 분석과정에서 SAMtools flagstat는 입력(input) 데이터로 BAM 파일을 사용하며, 출력(output) 데이터로는 정렬 통계가 포함된 텍스트 형태의 요약 보고서를 생성합니다.

SAMtools는 고처리량 시퀀싱 데이터를 조작하고 분석하기 위해 설계된 다목적 도구 모음으로, 특히 SAM, BAM, CRAM 형식의 정렬 데이터를 처리하는 데 사용됩니다. 이 도구는 변이 호출, 정렬 데이터 확인, 품질 관리 등 다양한 작업에 널리 활용됩니다. SAMtools는 인덱싱, 정렬, 병합, 필터링 등 정렬 파일 처리에 필요한 다양한 기능을 지원하며, 유전체 분석 파이프라인에서 필수적인 도구입니다. SAMtools sort 명령은 SAM, BAM, CRAM 파일을 지정된 기준에 따라 정렬합니다. 기본적으로 좌표(coordinate) 기준으로 정렬하며, -n 옵션을 사용하면 쿼리 이름(query name) 기준으로 정렬합니다. 정렬 순서는 SAM 파일 헤더의 @HD 태그 내 SO 필드에 표시됩니다. 좌표 정렬은 @HD SO:coordinate, 쿼리 이름 정렬은 @HD SO:queryname으로 헤더에 기록됩니다. 좌표 정렬 (Coordinate Sorting)의 경우, 읽기는 다음과 같은 순서로 정렬됩니다: 1. 참조 시퀀스 이름(RNAME): @SQ 태그에 정의된 참조 시퀀스 사전의 순서를 따릅니다. 2. 가장 왼쪽 매핑 위치(POS): 동일한 RNAME 내에서 읽기의 시작 위치를 기준으로 정렬됩니다. 3. REVERSE 플래그: POS가 동일한 경우, 순방향 가닥(forward strand, REVERSE 플래그 0)이 역방향 가닥(reverse strand, REVERSE 플래그 1)보다 먼저 옵니다. 이후 추가적인 동점이 있는 경우, 정렬 순서는 입력 데이터의 순서를 유지할 수 있습니다. 쿼리 이름 정렬 (Query Name Sorting)의 경우, -n 옵션을 사용하며 읽기는 다음과 같은 순서로 정렬됩니다: 1. 쿼리 이름(QNAME): 자연스러운 순서(natural order)로 정렬되며, 문자열 내 숫자 부분은 수치적으로 비교됩니다 (예: "read9"는 "read10"보다 먼저). 2. READ1/READ2 플래그: 동일한 QNAME을 가진 읽기는 첫 번째 읽기(READ1, 플래그 0x40)가 두 번째 읽기(READ2, 플래그 0x80)보다 먼저 옵니다. 3. 정렬 유형: READ1/READ2가 동일한 경우, 주 정렬(primary alignment)이 먼저 오고, 그 다음 보조 정렬(supplementary alignment), 2차 정렬(secondary alignment) 순으로 정렬됩니다. 남은 동점은 입력 데이터의 원래 순서를 따릅니다. 따라서 SAMtools는 유전체 데이터를 효율적으로 처리하고 분석하는 데 중요한 역할을 하며, 특히 정렬 작업에서 sort 도구가 유용하게 사용됩니다. Bio-Express의 Whole Genome Sequencing Pipeline 분석과정에서 SAMtools sort는 SAM파일을 입력 데이터로 사용하여 BAM 파일을 출력합니다.